siRNA原理分子构成、作用机制、设计递送与应用考量

siRNA是什么：其分子构成与核心功能

小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）是RNA干扰（RNAi）现象中的关键效应分子之一，它在细胞内扮演着精确、高效基因沉默的角色。理解siRNA的本质，是掌握其强大生物学功能和应用潜力的基础。

siRNA的本质与结构特征

从分子层面来看，siRNA是一种双链RNA（dsRNA）分子，其长度通常在20到27个核苷酸之间，最常见的长度是21或22个核苷酸。它具有以下几个显著的结构特征：

• 双链结构：siRNA由两条完全互补或近乎完全互补的RNA链组成，这两条链通过Watson-Crick碱基配对形成双螺旋结构。
• 突出端：siRNA的两端通常带有2个核苷酸的3’突出端（3′ overhang），这种结构对于其后续与Dicer酶的结合和RISC复合体的形成至关重要。例如，一个21nt的siRNA，其双链部分是19bp，两端各有一个2nt的3’突出端。
• 磷酸基团：siRNA的5’端通常带有磷酸基团，3’端则带有羟基。5’磷酸基团是RISC复合体识别和整合引导链的必要条件。

在天然细胞中，siRNA通常来源于长链双链RNA（如病毒RNA或转座子产生的dsRNA）被Dicer酶切割后的产物。而在实验室或治疗应用中，siRNA则可以被人工合成，或者通过表达短发夹RNA（shRNA）的载体在细胞内进行转录和加工。

siRNA的核心功能在于其能够引导RNA诱导沉默复合体（RISC）特异性地降解与其序列互补的信使RNA（mRNA）分子，从而阻止该基因的蛋白质表达，实现基因的沉默。

siRNA与RNA干扰（RNAi）机制的基石

siRNA是RNA干扰（RNAi）机制的重要组成部分。RNAi是一种高度保守的基因表达调控机制，通过小RNA分子引导的序列特异性方式抑制基因表达。siRNA介导的RNAi主要涉及以下几个步骤：

1. siRNA的产生：长的双链RNA分子（无论是内源性病毒RNA、转座子，还是外源性导入的长dsRNA）被Dicer酶识别并切割成短的双链siRNA分子。
2. RISC复合体形成：产生的siRNA与Argonaute（Ago）蛋白家族成员以及其他辅助蛋白共同组装成RNA诱导沉默复合体（RISC）。
3. 引导链选择：在RISC复合体中，siRNA的双链被解旋，其中一条链（通常是热力学稳定性较低的一条，即“乘客链”）被降解或释放，另一条链（“引导链”或“反义链”）则保留在RISC中。
4. 靶mRNA识别与降解：保留在RISC中的引导链，凭借其与目标mRNA的高度序列互补性，特异性地结合到目标mRNA上。随后，RISC中的Argonaute蛋白（通常是Ago2）发挥核酸内切酶活性，在siRNA引导链与mRNA配对区域的特定位置切割并降解目标mRNA。

值得注意的是，siRNA与微小RNA（miRNA）虽然都参与RNAi途径，但它们在来源、序列互补性和作用机制上存在显著差异：

• 来源：siRNA通常来源于长dsRNA的切割，而miRNA则来源于细胞自身基因组编码的短发夹结构（pri-miRNA和pre-miRNA）。
• 互补性：siRNA与靶mRNA通常表现出近乎完美的序列互补，导致靶mRNA被切割降解。miRNA与靶mRNA的互补性则通常不完美，主要通过抑制翻译或促进mRNA去腺苷化来抑制基因表达，尽管在某些情况下也可导致mRNA降解。
• 功能：siRNA主要参与对外源遗传物质（如病毒）的防御和转座子的抑制，以及在实验室中用于特异性基因沉默；miRNA则广泛参与细胞发育、分化、增殖和凋亡等多种生理过程的内源性基因表达调控。

siRNA为什么能沉默基因：核心机制深度解析

siRNA之所以能够特异且高效地沉默基因，其核心在于它独特的作用机制，即通过序列互补性引导的mRNA降解。这与DNA水平的基因编辑或转录水平的基因抑制截然不同，它直接干预了蛋白质合成的关键中间步骤。

特异性识别与高效降解

siRNA介导的基因沉默，其高效性和特异性主要体现在以下几个方面：

• 精确配对原则：这是siRNA特异性的基石。siRNA的引导链（guide strand）与目标mRNA之间需要满足高度的序列互补性。通常认为，至少需要19个连续的碱基对完美匹配，才能确保RISC的有效切割。这种精确的碱基配对保证了siRNA只针对特定的mRNA分子发挥作用，而不会影响其他非靶标mRNA的表达。如果配对不完美，尤其是种子区（通常指siRNA的第2-8位核苷酸）的错配，将大大降低其沉默效率或导致完全失效。
• RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成与作用：
  1. Dicer切割与siRNA产生：长的双链RNA（>30 bp）首先被核酸酶Dicer识别并切割成20-27 bp的siRNA双链分子。Dicer酶在切割过程中会产生具有2个核苷酸3’突出端的siRNA，这种结构是RISC组装的关键识别信号。
  2. RISC组装与引导链选择：产生的siRNA双链分子随后与多种蛋白因子，特别是Argonaute（Ago）家族蛋白，共同组装成RISC。在组装过程中，siRNA双链会被解旋，其中一条链（称为“乘客链”，passenger strand）通常被降解或释放，而另一条链（称为“引导链”，guide strand）则稳定地与Ago蛋白结合，并作为识别靶mRNA的模板。引导链的选择并非随机，通常是siRNA双链中5’端结合强度较低的那条链，这通常导致5’端热力学不稳定的那条链被选为引导链。
  3. 靶mRNA识别与切割：一旦RISC负载了引导链，它便开始在细胞质中“巡逻”，寻找与引导链序列互补的mRNA分子。当发现互补的靶mRNA时，引导链会与靶mRNA形成RNA-RNA双螺旋。此时，RISC中的Argonaute蛋白（在哺乳动物中主要是Ago2）将发挥其内在的核酸内切酶活性，在siRNA引导链与mRNA配对区域的中间位置（通常是siRNA引导链5’端数起第10-11位磷酸二酯键处）对靶mRNA进行精确切割。
  4. mRNA降解：被切割的mRNA分子失去完整性，极不稳定，很快会被细胞内的核酸酶（如Xrn1）完全降解。由于mRNA的降解，细胞便无法再利用该mRNA分子来合成蛋白质，从而实现基因的沉默。

选择双链RNA作为起始分子（无论是天然的还是人工合成的）是siRNA介导基因沉默高效性的重要原因。双链结构能够被Dicer酶有效识别和加工，确保了siRNA的正确尺寸和结构。同时，双链结构也赋予了siRNA相对单链RNA更高的稳定性，使其在递送和细胞内发挥作用时不易被核酸酶降解。

相较于其他基因沉默方法的优势

相较于传统的基因敲除（如CRISPR-Cas9）或抗义寡核苷酸（ASO），siRNA具有一些独特的优势：

• 高效性：siRNA能够在纳摩尔（nM）甚至皮摩尔（pM）浓度下实现显著的基因沉默效果。RISC复合体在降解靶mRNA后可以被循环利用，一个RISC可以降解多个mRNA分子，因此具有催化放大的效应。
• 特异性：基于高度序列互补性，siRNA能够精准靶向目标基因，减少脱靶效应。
• 快速性：siRNA直接作用于mRNA层面，基因沉默效果通常在转染后24-48小时内即可观察到，比敲除基因组DNA需要更短的时间。
• 可逆性（相对）：siRNA分子本身不会整合到宿主基因组中，其作用会随着siRNA的降解和细胞的分裂而逐渐减弱，从而实现一定程度的可逆性。这在某些需要临时性基因抑制的研究或治疗中具有优势。
• 操作简便：体外合成的siRNA可以直接转染细胞，操作相对简单，不需要复杂的病毒载体构建（尽管病毒载体也可用于表达shRNA前体）。
• 药物开发潜力：其序列特异性使得siRNA在靶向致病基因方面展现出巨大的治疗潜力，尤其是在那些难以用小分子药物靶向的“不可成药”靶点。

siRNA作用在哪里：细胞内定位与潜在应用领域

理解siRNA的精确作用位置及其在各种领域的应用，有助于我们更好地利用这一强大的工具。

细胞内作用靶点与场所

siRNA介导的基因沉默主要发生在细胞质中。具体来说：

• 起始：长的双链RNA在细胞质中或细胞核外被Dicer酶切割成siRNA。
• RISC组装：siRNA与Argonaute蛋白及其他因子在细胞质中组装成RISC复合体。
• 靶mRNA识别与降解：成熟的RISC复合体携带siRNA引导链，在细胞质中寻找并结合到与其高度互补的目标mRNA上。随后，在细胞质中，RISC中的Argonaute蛋白切割目标mRNA，导致其降解。

因此，siRNA主要通过降解细胞质中的mRNA来抑制基因表达，不会直接影响基因组DNA或核内的转录过程。

研究与治疗领域的应用概览

siRNA的强大基因沉默能力使其在生命科学研究和疾病治疗领域都展现出广阔的应用前景：

1. 基础研究：
   • 基因功能研究：通过沉默特定基因，观察细胞或生物体表型的变化，从而推断该基因的功能。这是功能基因组学研究的基石。
   • 信号通路解析：通过逐个或组合沉默通路中的关键基因，揭示不同基因之间的相互作用和调控关系。
   • 药物靶点验证：在药物开发早期，利用siRNA沉默特定基因，评估其作为药物靶点的可行性。
2. 药物开发：
   • 靶向致病基因：针对与疾病发生发展密切相关的致病基因，设计siRNA来抑制其表达，从而达到治疗目的。例如，针对肿瘤细胞中过度表达的癌基因，或病毒感染细胞中复制所需的病毒基因。
   • 高通量筛选：构建siRNA库，进行高通量筛选，以发现与特定表型相关的基因，或鉴定新的药物靶点。
3. 治疗潜力：
   • 癌症治疗：靶向癌细胞增殖、转移、血管生成或耐药性相关的基因。已有siRNA药物获批用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性，并有大量处于临床试验阶段的siRNA药物针对肝癌、卵巢癌等。
   • 病毒感染：通过沉默病毒复制所需的基因（如HIV、HBV、HCV、RSV等），抑制病毒在宿主细胞内的增殖。
   • 遗传性疾病：通过沉默导致疾病的突变基因或功能获得性基因。例如，已有siRNA药物获批治疗急性肝卟啉症。
   • 神经退行性疾病：靶向导致神经元损伤的基因，如亨廷顿病、阿尔茨海默病等。
   • 眼部疾病：如湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）的局部治疗。
   • 心血管疾病：通过降低某些基因的表达来改善血脂代谢或血管功能。

siRNA的“量”：长度、匹配度与持续效应

siRNA在发挥功能时，其分子本身的“量”（长度、匹配度）以及所产生的“量”（基因沉默的程度和持续时间）都是决定其效能的关键因素。

理想的siRNA长度与完美匹配度

• 最佳siRNA长度：虽然siRNA的长度范围在20-27个核苷酸，但大量研究表明，21-23个核苷酸的双链siRNA通常能达到最佳的基因沉默效果。这是因为Dicer酶在切割长dsRNA时，倾向于产生这个长度范围的产物，并且这个长度的siRNA能够最有效地被Argonaute蛋白结合并整合到RISC中。过长或过短的siRNA可能会降低Dicer的加工效率，影响RISC的组装或稳定性，甚至可能激活非特异性免疫反应。
• 匹配要求：siRNA的引导链与目标mRNA之间需要极高的序列互补性。通常要求至少有19个连续的碱基对实现完美匹配，才能诱导Argonaute蛋白进行高效的mRNA切割。如果在siRNA的“种子区”（通常指引导链的第2-8位核苷酸）存在错配，即使其他区域互补，也可能导致沉默效率显著下降，甚至完全失效。这是siRNA特异性的重要保证，但也意味着一旦目标基因发生突变，siRNA的效能可能会受影响。

基因沉默效应的持续时间

siRNA介导的基因沉默效应并非永久性的，其持续时间受多种因素影响，通常从几天到一周不等，但也可通过特定策略延长：

• siRNA的稳定性：未修饰的siRNA在细胞内容易被核酸酶降解，导致其半衰期相对较短。
• 细胞分裂频率：对于快速分裂的细胞，细胞分裂会稀释细胞内siRNA分子的浓度，从而缩短沉默效果的持续时间。
• 目标mRNA的周转率：如果目标mRNA本身不稳定，siRNA的沉默效果可能会更快显现，但一旦siRNA降解，新的mRNA很快就会被合成。
• 递送方式：一次性转染的siRNA通常持续时间有限。如果siRNA能够被稳定地表达（例如通过病毒载体表达shRNA，其在细胞内持续加工生成siRNA），或者通过持续递送系统（如长效脂质纳米粒）缓慢释放siRNA，则基因沉默效果可以维持数周甚至数月。

有效基因沉默所需的siRNA浓度

实现有效基因沉默所需的siRNA浓度取决于多种因素，包括细胞类型、转染效率、目标基因的表达水平、siRNA的设计效率以及下游检测方法的灵敏度等：

• 体外研究：在细胞培养实验中，siRNA的工作浓度通常在1 nM到100 nM之间。对于易于转染的细胞和高表达的基因，可能在几纳摩尔就能观察到显著效果；而对于难转染的细胞或低表达的基因，可能需要更高的浓度。过高的siRNA浓度可能会增加脱靶效应和细胞毒性的风险。
• 体内应用：在活体动物或人体内，由于递送效率、siRNA在血清中的稳定性、组织分布和代谢等复杂因素，所需的siRNA剂量通常远高于体外。这通常需要更优化的递送系统和更精准的剂量探索。

在实际实验中，通常会进行剂量响应曲线实验，以确定实现最大基因沉默效果且副作用最小的最佳siRNA浓度。

如何设计与递送siRNA：实践中的考量

siRNA的成功应用不仅依赖于其原理，更离不开精心的序列设计和高效安全的递送策略。

siRNA序列的设计原则

一个高效且特异的siRNA序列设计是实验成功的关键。以下是siRNA设计中需要考虑的一些主要原则：

• 靶序列选择：
  • 起始位点：避开mRNA的5’和3’非翻译区（UTR），因为这些区域可能含有复杂的二级结构或结合其他蛋白，影响siRNA的结合。通常选择在开放阅读框（ORF）内设计siRNA。
  • 避免重复序列和结构域：避开mRNA中具有长重复序列或已知形成复杂稳定二级结构的区域，这些可能影响siRNA的结合效率。
  • GC含量：通常建议GC含量在30%到60%之间，过高或过低的GC含量都可能影响siRNA的活性或特异性。
  • SNP位点：如果目标基因存在单核苷酸多态性（SNP），应避免在siRNA序列中包含这些SNP位点，以确保对所有目标等位基因的有效沉默。
• 核苷酸偏好：
  • 5’端偏好：研究表明，siRNA引导链的5’端第一个核苷酸是腺嘌呤（A）或尿嘧啶（U）通常具有更高的活性。这是因为Ago蛋白对5’端A或U的识别有偏好性。
  • 不对称：设计siRNA时，可以考虑让引导链的5’端相对于乘客链的5’端，具有更低的热力学稳定性，以利于RISC对引导链的选择。
• 脱靶效应预测：
  • 生物信息学工具：利用专业的siRNA设计软件和生物信息学工具（如BLAST、siRNA Finder等）对候选siRNA序列进行全面的数据库比对，确保其与目标mRNA高度互补，同时最大程度地减少与其他非靶基因的互补性，尤其是种子区（seed region）的匹配。
  • 避免miRNA模拟：检查siRNA序列（特别是种子区）是否与已知的miRNA序列相似，以避免不必要的miRNA样脱靶效应。
• 化学修饰：为了增强siRNA的稳定性、降低免疫原性并改善药代动力学特性，通常会对siRNA进行化学修饰：
  • 磷酸硫代修饰（Phosphorothioate, PS）：将磷酸二酯键中的一个非桥氧原子替换为硫原子，可以提高siRNA对核酸酶降解的抵抗力。
  • 2′-O-甲基修饰：在核糖的2’位置引入甲基，可以增强siRNA的核酸酶抗性，并可能降低脱靶效应和免疫原性。
  • 糖类或胆固醇偶联：与特定的配体（如N-乙酰半乳糖胺, GalNAc）偶联，可以实现肝脏等特定器官的靶向递送。

有效的siRNA递送方法

siRNA分子本身带有负电荷，且易被核酸酶降解，因此需要有效的递送系统将其安全高效地送入细胞质。递送方法大致可分为体外和体内两种。

体外递送

在细胞培养实验中，常用的siRNA递送方法包括：

• 脂质体转染：这是最常用的方法之一。阳离子脂质体可以与带负电荷的siRNA形成复合物，通过内吞作用进入细胞。脂质体具有较低的毒性、操作简便和相对较高的转染效率。
• 电穿孔：通过高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙，使siRNA直接进入细胞。这种方法效率高，适用于难转染的细胞，但可能对细胞造成一定损伤。
• 病毒载体：虽然siRNA本身不是病毒，但可以利用病毒载体（如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒等）来表达短发夹RNA（shRNA），shRNA在细胞内被Dicer酶加工成siRNA。病毒载体具有高转染效率和长期基因表达的优势，但可能存在免疫原性、插入突变等风险。

体内递送的挑战与策略

将siRNA递送到活体生物体内进行治疗应用面临更大的挑战：

• 稳定性问题：在血浆中，裸露的siRNA极易被核酸酶降解，半衰期仅为几分钟。
  • 策略：化学修饰（如PS、2′-O-甲基修饰）、纳米颗粒包裹。
• 靶向性问题：siRNA在体内容易被非特异性地分布到各个组织和器官，难以实现对特定病变部位的富集。
  • 策略：连接靶向配体（如GalNAc靶向肝脏）、纳米颗粒包封实现被动靶向（如肿瘤的EPR效应）。
• 免疫原性问题：未修饰的siRNA可能被宿主细胞内的模式识别受体（如TLR3、TLR7/8）识别，激活先天免疫反应，导致细胞因子释放和毒性。
  • 策略：化学修饰、纯化去除杂质、纳米颗粒包裹以屏蔽siRNA。
• 细胞摄取与内体逃逸：即使siRNA进入细胞，也常被困在内体（endosome）中，最终被降解，无法到达细胞质中的RISC。
  • 策略：设计具有内体逃逸能力的递送载体，如特定的脂质体、多聚物。

针对这些挑战，目前主要采用以下递送载体：

• 脂质纳米粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）：这是目前临床应用中最成功的siRNA递送系统。LNPs由阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG脂质组成，能有效包裹siRNA，保护其免受降解，并通过内吞途径进入细胞，并辅助内体逃逸。
• 多肽和适配体偶联：将siRNA直接偶联到具有细胞穿透能力的多肽或特定靶向适配体上，实现对特定细胞的靶向递送。
• 高分子聚合物：如聚乙烯亚胺（PEI）、环糊精衍生物等，它们能与siRNA形成聚合物-siRNA纳米复合物，具有保护siRNA和辅助内体逃逸的作用。
• GalNAc偶联siRNA：将siRNA与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联，GalNAc能特异性结合肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），实现对肝脏的高效靶向递送。这是目前已上市siRNA药物最主要的递送策略。

如何评估与优化siRNA的效能

在实际应用中，对siRNA的基因沉默效果进行准确评估，并针对可能出现的问题进行优化，是确保实验或治疗成功的关键。

基因沉默效率的检测方法

衡量siRNA的基因沉默效率，通常需要从mRNA和蛋白质两个层面进行评估，有时还需要结合功能性表型观察。

• mRNA水平的检测：
  • 定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）：这是最常用且灵敏的方法，通过检测靶基因mRNA的相对表达量来评估沉默效果。与未处理或用对照siRNA处理的细胞相比，如果靶基因mRNA水平显著下降，则表明siRNA有效。
  • Northern Blot：一种传统的RNA检测方法，通过电泳分离RNA后与标记探针杂交，可以直接观察到靶mRNA的减少。
  • RNA测序（RNA-seq）：在高通量研究中，RNA-seq可以全面分析细胞内所有RNA的表达变化，不仅能评估靶基因的沉默效果，还能发现潜在的脱靶效应。
• 蛋白质水平的检测：
  • 蛋白质印迹（Western Blot）：通过抗体检测靶蛋白的表达量。mRNA水平的下降通常会伴随蛋白质水平的相应降低，但由于蛋白质半衰期不同，蛋白质水平的下降可能会滞后于mRNA。
  • 酶联免疫吸附测定（ELISA）：用于定量检测分泌型或可溶性靶蛋白的表达量。
  • 免疫荧光或免疫组织化学：通过荧光或酶标抗体在细胞或组织中可视化靶蛋白的表达和定位，以评估沉默效果。
• 表型观察：

  在许多情况下，基因沉默的最终目的是观察其对细胞功能或生物体表型的影响。这可能包括：

  • 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的变化。
  • 细胞周期分布的改变。
  • 特定代谢产物水平的检测。
  • 在动物模型中，疾病症状的缓解或改善。

常见问题与优化策略

在使用siRNA时，可能会遇到一些问题，如脱靶效应、免疫反应和实验效果不佳。以下是一些常见的优化策略：

脱靶效应的规避

脱靶效应指siRNA意外地沉默了与目标基因不相关的其他基因。这可能是由于siRNA与非靶基因的mRNA存在部分互补，尤其是在种子区（seed region）的相似性，从而引发miRNA样机制的基因抑制。

• 设计优化：
  • 序列比对：使用专业的生物信息学工具，在设计阶段严格筛选siRNA序列，确保其与目标mRNA高度特异性，并尽可能减少与非靶基因mRNA的种子区匹配。
  • 多重siRNA：设计并测试多个靶向同一基因但不同区域的siRNA，或使用混合siRNA，因为不同siRNA的脱靶模式通常不同。
• 降低浓度：使用能够达到有效基因沉默的最低siRNA浓度，可以显著降低脱靶效应的风险。
• 对照实验：
  • 乱序siRNA（scrambled siRNA）：使用与靶siRNA长度和GC含量相似但序列随机、不与任何已知基因互补的siRNA作为阴性对照。
  • 无关siRNA：使用靶向宿主细胞中不表达的基因（如荧光素酶）的siRNA作为阴性对照。
• 化学修饰：适当的化学修饰可以改善siRNA的特异性，例如在可能引起脱靶效应的位点进行修饰。

免疫反应的控制

未修饰的siRNA，特别是含有某些序列基序（如UGUG）的siRNA，可能被细胞内的模式识别受体（如TLR3、TLR7/8、RIG-I、MDA5）识别，从而激活先天免疫反应，导致细胞因子（如IFN-α/β）的产生，引起非特异性毒性或炎症。

• 化学修饰：在siRNA骨架上进行化学修饰，如2′-O-甲基修饰、硫代磷酸酯修饰，可以有效降低siRNA的免疫原性。
• 纯化：使用高效液相色谱（HPLC）等方法纯化siRNA，去除合成过程中产生的杂质（如单链RNA或未完全纯化的核酸），这些杂质也可能诱导免疫反应。
• 递送系统：将siRNA包裹在递送载体（如LNP）中，可以物理性地屏蔽siRNA，阻止其与细胞内的免疫识别受体结合。

实验条件的优化

即使siRNA设计合理，递送成功，实验条件的细微差异也可能影响结果。

• 转染试剂选择：针对不同细胞类型，选择最适合的转染试剂和优化转染条件（如转染试剂用量、siRNA浓度、孵育时间等）。
• 细胞密度：在转染时保持合适的细胞密度，过高或过低都可能影响转染效率和细胞健康。
• 孵育时间：根据实验目的和靶基因的周转率，确定合适的siRNA作用时间，通常在转染后24-72小时内进行检测。
• 对照组设置：除了上述提到的脱靶对照，还应设置空白对照（未处理细胞）、转染试剂对照（只加转染试剂不加siRNA）等，以全面评估实验结果。
• 多次重复实验：通过生物学重复和技术重复，确保结果的可靠性和可重复性。